TECNICHE BIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARI

BIO/12 - 8 CFU - 1° semestre

Docente titolare dell'insegnamento

VINCENZA BARRESI

Obiettivi formativi

Lo studente acquisirà competenze relative alle tecniche per l'analisi degli aspetti biochimici delle cellule dei procarioti ed eucarioti e delle tecniche di colture cellulari, anche su larga scala; per lo studio della struttura, funzioni ed analisi delle macromolecole biologiche e dei processi cellulari nelle quali esse intervengono.

Modalità di svolgimento dell'insegnamento

Lezioni frontali ed esercitazioni pratiche in laboratorio

Prerequisiti richiesti

Conoscenze acquisite durante i corsi di laurea triennale in chimica, in biologia e in biotecnologie

Frequenza lezioni

Le lezioni si svolgono durante il secondo anno, primo semestre, sei-otto ore la settimana.

Contenuti del corso

Colture cellulari: colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura

Saggi per l’analisi del ciclo cellulare, proliferazione cellulare, vitalità e morte cellulare.

Reazione di polimerizzazione a catena (PCR), sintesi di cDNA tramite Trascrizione inversa. Parametri e programmi bioinformatici per la progettazione di primers per PCR (primer 3 NCBI).

Analisi qualitativa e quantitativa di trascritti.

Valutazione di polimorfismi tramite PCR quantitativa o “real-time PCR”

Reazione di digestione con enzimi di restrizione. Reazioni con enzimi di modificazione.

Estrazione e dosaggio spettrofotometrico di acidi nucleici e proteine.

Elettroforesi di acidi nucleici e di proteine.

Tecniche di ibridazione. Preparazione di filtri tramite la tecnica del Southern blot, del Northern blot e del Western blot.

Preparazione di campioni di DNA o di RNA per l’analisi globale del genoma e dell’espressione mediante microarrays.

Tecniche di Sequenziamento degli acidi nucleici di I, II e III generazione

Analisi delle modificazioni epigenetiche (metilazione)

Tecniche di trasfezione transitoria e stabile e di soppressione dell’espressione genica mediante “RNA interference”

La tecnologia del DNA ricombinante e il clonaggio: preparazione di un vettore plasmidico ricombinante; trasformazione batterica ed estrazione di DNA plasmidico

Valutazione di attività enzimatica in campioni biologici.

Banche dati.

Le tecniche di laboratorio biochimico e biomolecolare nella diagnostica molecolare medica.

Esperienze di laboratorio

Esp 1 Colture Cellulari appartenenti a linee continue umane

Esp 2 Dosaggio di acidi nucleici

Esp 4 Elettroforesi in gel d’agarosio

Esp 3 Estrazione DNA da colture cellulari continue

Esp 5 Sintesi cDNA

Esp 9 Trasfezioni e Silenziamento

Esp 7 Digestione con enzimi di restrizione

Esp 6 Reazione a catena delle polimerasi (PCR)

Exp 8 PCR quantitativa/qRT Discriminazione Allelica

Testi di riferimento

1)Fondamenti di biologia molecolare, L. A. Allison, Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi, et al. Casa Editrice Ambrosiana – Zanichelli. 3)Metodologie biochimiche. Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine, M. L. Di Salvo, et al. CEA. 4) Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso, 5) Video-corso online di “Biotecnologie Diagnostiche” composto da 3 lezioni ed una esercitazione di laboratorio prodotto all’interno di un progetto didattico europeo (D.F. Condorelli, V. Barresi) http://www.dsf.unict.it/index.php?page=progetto-phar-in, Video-corso online "Riparazione del Dna e mutagenesi nel cancro" (D.F. Condorelli): Mismatch repair (MMR) instabilità dei microsatelliti (V. Barresi), Video-lezioneTecnologie avanzate per la Bio-Medicina Genomica (Vincenza Barresi),.

Altro materiale didattico

Video-corso online di “Biotecnologie Diagnostiche” composto da 3 lezioni ed una esercitazione di laboratorio prodotto all’interno di un progetto didattico europeo (D.F. Condorelli, V. Barresi) http://www.dsf.unict.it/index.php?page=progetto-phar-in.

Video-corso online su piattaforma Eduopen (https://learn.eduopen.org/): "Riparazione del Dna e mutagenesi nel cancro" (D.F. Condorelli): Mismatch repair (MMR) instabilità dei microsatelliti (V. Barresi)

Video-lezioneTecnologie avanzate per la Bio-Medicina Genomica (Vincenza Barresi)

Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso

Programmazione del corso

	Argomenti	Riferimenti testi
1	Colture cellulari: colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
2	Saggi per l’analisi del ciclo cellulare, proliferazione cellulare, vitalità e morte cellulare.	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
3	Reazione di polimerizzazione a catena (PCR), sintesi di cDNA tramite Trascrizione inversa.	1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
4	Parametri e programmi bioinformatici per la progettazione di primers per PCR (primer 3 NCBI). Analisi qualitativa e quantitativa di trascritti.	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
5	Estrazione e dosaggio spettrofotometrico di acidi nucleici.	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
6	Estrazione e dosaggio spettrofotometrico di proteine.	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
7	Elettroforesi di acidi nucleici .	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso, Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
8	Tecniche di ibridazione. Preparazione di filtri tramite la tecnica del Southern blot, del Northern blot e del Western blot.	1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
9	Preparazione di campioni di DNA o di RNA per l’analisi globale del genoma e dell’espressione mediante microarrays.	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
10	Tecniche di Sequenziamento degli acidi nucleici di I, II e III generazione	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
11	Analisi delle modificazioni epigenetiche (metilazione)	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
12	Tecniche di trasfezione transitoria e stabile e di soppressione dell’espressione genica mediante “RNA interference”	1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
13	La tecnologia del DNA ricombinante e il clonaggio: preparazione di un vettore plasmidico ricombinante; trasformazione batterica ed estrazione di DNA plasmidico	1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
14	Valutazione di attività enzimatica in campioni biologici.	1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
15	Banche dati.	1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
16	Le tecniche di laboratorio biochimico e biomolecolare nella diagnostica molecolare medica.	1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA
17	Esperienze di laboratorio Esp 1 Colture Cellulari appartenenti a linee continue umane	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
18	Esperienze di laboratorio Esp 2 Dosaggio di acidi nucleici	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
19	Esperienze di laboratorio Esp 3 Elettroforesi in gel d’agarosio	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
20	Esperienza di laboratorio Esp 4 Reazione a catena delle polimerasi (PCR)	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
21	Esperienza di laboratorio Esp 5 Progettazione primers per amplificazione PCR	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
22	Esperienza di laboratorio Esp 6 Analisi di sequenze di acidi nucleici in banche dati	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso
23	Esperienza di laboratorio Esp 7 Trasfezioni e Silenziamento	Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso

Verifica dell'apprendimento

MODALITÀ DI VERIFICA DELL'APPRENDIMENTO

Esame Orale

ESEMPI DI DOMANDE E/O ESERCIZI FREQUENTI

Condizioni per mantenere linee continue di colture cellulari eucariotiche (Conoscenze teoriche e pratiche per essere effettuata in laboratorio)

Saggi di vitalità cellulari (Conoscenze teoriche e pratiche per essere effettuata in laboratorio)

Reazione a catena delle polimerasi (condizioni per effettuare una reazione in laboratorio)

Procedure per sequenziare frammenti di acidi nucleici

Procedure per valutare quantitativamente frammenti di acidi nucleici

Dosaggio spettrofotometrico di acidi nucleici e proteine

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