TECNICHE BIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARI

Gli studenti acquisiranno sia una conoscenza teorico/pratica di metodologie biomolecolari di base utili all’analisi sperimentale sia competenze applicative da impiegare nel campo delle discipline biomolecolari. Durante le ore di laboratorio previste gli studenti acquisiranno competenze pratiche all'utilizzo delle tecniche biomolecolari studiate, con particolare attenzione alle applicazioni dell’ingegneria genetica, all'utilizzo di proteine ricombinanti e alle tecniche di analisi in fluorescenza (Microscopia ad epifluorescenza e Citofluorimetria di flusso). Gli studenti saranno inoltre in grado di valutare e discutere i risultati ottenuti.

Lezioni frontali e esecitazioni pratiche in laboratorio

E' preferibile avere superato gli esami di biochimica e di biologia molecolare.

obbligatoria

Manipolazione acidi nucleici e proteine e relativa analisi:

Isolamento di DNA, RNA e proteine da campioni biologici; esempi ed applicazioni. DIGE. Blotting (Western, Eastern).

Vettori plasmidici e vettori fagici

Tecniche per l'analisi dell'espressione genica:
PCR semiquantitativa, competitiva, qPCR. Microarrays a cDNA e ad oligonucleotidi; SAGE, Differential-display

Analisi delle interazioni proteina-proteina:
Tecniche di display in vitro: Protein Arrays, Pull-down, mRNA display e Ribosome display.
Tecniche di display in vivo: Co-Immunoprecipitazione, Tandem Affinity Purification (TAP) system, Phage Display

Tecniche di mutagenesi:
Metodi di mutagenesi sito-specifica o casuale: mutagenesi a cassetta, mutagenesi per estensione di un primer, mutagenesi mediante PCR. Mutagenesi applicata allo studio dei promotori: mutagenesi linker-scanning. Applicazioni della PCR.

Analisi di parametri cellulari mediante microscopia digitale ad epifluorescenza. Uso di biosensori fluorescenti in microscopia, marcature multiple di strutture intracellulari ed analisi in live imaging. Espressione in cellule umane di proteine chimeriche fluorescenti. Uso di sonde ricombinanti fluorescenti (Bax-GFP) come biosensori di apoptosi.

Analisi di parametri cellulari mediante citofluorimetria di flusso:. Principi fisici della citofluorimetria, analisi di popolazioni cellulari basate sullo scattering della luce e/o sulla fluorescenza e loro analisi attraverso programmi dedicati. Uso di sonde ricombinanti fluorescenti come biosensori di apoptosi e analisi della dispersione di fluorescenza in citofluorimetria.

Biotecnologie molecolari, principi e tecniche. Brown TA, 2017, Zanichelli editore

DNA ricombinante. Watson, Caudy, Myers, Witkowski, 2008 ed., Zanichelli editore

Genomi 4. Brown TA, ultima ed., EdiSes editore

Materiale didattico aggiuntivo sarà fornito dal docente.

orale

- proteine ricombinanti

- proteine reporter

- vettori fagici e plasmidici

- analisi in citometria di flusso

- analisi in microscopia ad epifluorescenza

- sonde fluorescenti

- tecniche di mutagenesi

- tecniche di clonaggio